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 La seconda spedizione in Sud America partì da Genova il 3 luglio 1883. Il 20 settembre a bordo del "Messaggero", un vapore messo a disposizione dalla Compagnia "Lloyd Argentino" partirono per l'esplorazione delle "Missiones", un territorio compreso tra i fiumi Iguazù a nord, il Paranà ad ovest, il Paraguay a sud ed il rio Pepiri-guazù ad est. Percorsero il fiume Paranà sino a Posadas; poi risalirono fino al fiume Iguazù. Esplorarono per fiumi e per terre il territorio circostante a nord, est, ovest e sud.
Arrivarono fino alle cascate Guairà, poi tornarono a sud ovest. Percorsero il fiume Iguazù fino alle cascate Vittoria.
Avevano esplorato non solo le "Missiones" ma l'Alto Paraguay, il corso dei fiumi Paranà, Iguazù, Itambe-Guazù e le province brasiliane del Guayrà e del Mato Grosso.
Da Buenos Aires a bordo del "Valparaiso" ripartì il 29 gennaio 1884 per la Terra del Fuoco.
Esplorò ancora l'isola degli Stati, proponendo al governo argentino di fondare una stazione di salvataggio ed erigere un faro.
Incontrò il popolo dei Patagoni e fece studi su di loro e sulla loro civiltà.
Tornò in Italia con 25 grandi casse di materiale antropologico, etnografico, zoologico e botanico.
A questa spedizione che fece con la moglie Luisa, parteciparono anche Sarmiento che fu poi più volte presidente della Repubblica Argentina ed Edmondo De Amicis che già si trovava in sud America.
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